為了防止原代細(xì)胞因污染或技術(shù)原因使長(zhǎng)期培養(yǎng)功虧一簣，考慮到培養(yǎng)細(xì)胞因傳代而遲早會(huì)出現(xiàn)變異，有時(shí)因寄贈(zèng)、交換和購(gòu)買，培養(yǎng)細(xì)胞從一個(gè)實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)運(yùn)到另一個(gè)實(shí)驗(yàn)室，*的策略是進(jìn)行低溫保存。這對(duì)于維持一些特殊細(xì)胞株的遺傳特性極為重要。現(xiàn)簡(jiǎn)要介紹深低溫保存法(－70℃~－196℃)的特點(diǎn)。細(xì)胞深低溫保存的基本原理是：在－70℃以下時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的酶活性均己停止，即代謝處于*停止?fàn)顟B(tài)，故可以長(zhǎng)期保存。細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵，在于通過0~20℃階段的處理過程。在此溫度范圍內(nèi)，水晶呈針狀，極易招致細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。
一、細(xì)胞的凍存：為避免污染造成的損失，zui小化連續(xù)細(xì)胞系的遺傳改變和避免有限細(xì)胞系的老化和轉(zhuǎn)化，需要凍存哺乳細(xì)胞。凍存細(xì)胞前，細(xì)胞應(yīng)該特性化并檢查是否污染。
有幾種普通培養(yǎng)基用來(lái)凍存細(xì)胞。對(duì)于包含有血清的培養(yǎng)基，成分可能如下：
包含10％甘油的*培養(yǎng)基，
包含10％二甲基亞砜（DMSO）的*培養(yǎng)基，
50％ 細(xì)胞條件培養(yǎng)基和50％含有10％甘油的新鮮培養(yǎng)基，或
50％ 細(xì)胞條件培養(yǎng)基和50％含有10％二甲基亞砜的新鮮培養(yǎng)基。
對(duì)于無(wú)血清培養(yǎng)基，一些普通的培養(yǎng)基成分可能是：
50％ 細(xì)胞條件無(wú)血清培養(yǎng)基和50％包含有7.5％二甲基亞砜的新鮮的無(wú)血清培養(yǎng)基，或
包含有7.5％二甲基亞砜和10％細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)BSA的新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基。
1、懸浮細(xì)胞
計(jì)數(shù)將要凍存的活細(xì)胞。細(xì)胞應(yīng)該處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。以大約200～400g離心5分鐘沉淀細(xì)胞，使用移液管移去上清到zui小體積，不要攪亂細(xì)胞。
以1×107到5×107細(xì)胞/ml密度，在包含有血清的冷凍培養(yǎng)基中再次懸浮細(xì)胞，或者以0.5×107到1×1027在無(wú)血清培養(yǎng)基中，再次懸浮原代細(xì)胞。
分裝進(jìn)凍存管，將凍存管置于濕冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟。
細(xì)胞以1℃/分鐘進(jìn)行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進(jìn)行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存。
2、貼壁細(xì)胞
使用分離試劑從基層分離細(xì)胞，分離時(shí)盡可能溫和，使對(duì)細(xì)胞的損傷減少到zui小。
在*生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，再次懸浮分離細(xì)胞，確定有活力細(xì)胞數(shù)。
以大約200g離心5分鐘沉淀細(xì)胞。使用移液管移去上清到zui小體積，不要攪亂細(xì)胞。
以5×106到1×106細(xì)胞/ml密度，在凍存液中懸浮細(xì)胞。
分裝進(jìn)凍存管，將凍存管置于濕的冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟。
細(xì)胞以1℃/分鐘進(jìn)行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進(jìn)行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存。
二、凍存細(xì)胞的復(fù)蘇:凍存細(xì)胞較脆弱，要輕柔操作。凍存細(xì)胞要快速融化，并直接加入*生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。若細(xì)胞對(duì)凍存劑（DMSO或甘油）敏感，離心去除凍存培養(yǎng)基，然后加入*生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。
1、直接鋪板方法
取出貯存細(xì)胞，37℃水浴中快速融化。
直接用*生長(zhǎng)培養(yǎng)基鋪板細(xì)胞。1ml凍存細(xì)胞使用10~20ml*生長(zhǎng)培養(yǎng)基。進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞接種應(yīng)該至少在3×105活細(xì)胞/ml。培養(yǎng)細(xì)胞12到24小時(shí)，更換新鮮的*生長(zhǎng)培養(yǎng)基，去除凍存劑。
2、離心方法
取出貯存細(xì)胞，37℃水浴中快速融化。
把1到2ml凍存細(xì)胞加入到大約25ml*生長(zhǎng)培養(yǎng)基，輕輕混勻。
以大約80x g離心2到3分鐘。
棄去上清。
在*生長(zhǎng)培養(yǎng)基輕輕再次懸浮細(xì)胞，并且進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。
細(xì)胞鋪板，原代細(xì)胞接種應(yīng)該至少為3×105活細(xì)胞/ml。